Биосфера планеты Земля наполнена множеством удивительных организмов. Разные виды, обитающие в разных уголках планеты, обладают самыми разнообразными особенностями как физиологии, так и поведения. Внимание людей обычно привлекает нечто большое, порой пугающее, как синий кит или колоссальный кальмар. Их габариты, а также некая вуаль таинственности становятся вдохновением для творчества писателей и многочисленных исследований ученых. Однако можно быть гигантским и при этом невероятно крошечным, как, например, одноклеточный организм Spirostomum ambiguum. Но самое удивительное это не его габариты, а умение уменьшаться до четверти своего первоначального размера всего за 5 миллисекунд. Ученые из Университета штата Северная Каролина (США) провели подробное исследование Spirostomum ambiguum, дабы установить механизм, лежащий в основе столь разительного и быстрого изменения формы тела. В чем же секрет такого поведения, какие механизмы лежат в его основе, и как понимание этого может помочь людям? Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых.
Основа исследования
Гигантская одноклеточная инфузория Spirostomum способна стремительно сокращаться, уменьшаясь в длину с ~1 мм до ~300 мкм всего за 5 мс. Скорость этого процесса превышает ~100 длин тела в секунду. Для сравнения: отдельные мышечные волокна, сопоставимые по размерам, могут сокращаться на аналогичную относительную величину, однако их типичная максимальная скорость примерно в 10 раз ниже. Хотя родственные инфузории (например, Stentor) также демонстрируют масштабные сокращения, осуществляемые, вероятно, с помощью биохимически схожих механизмов, Spirostomum выделяется именно своей скоростью, особенно с учетом размеров организма. Кроме того, Spirostomum способна быстро повторять это движение, восстанавливая исходное состояние за несколько секунд. Этим она отличается от других биологических механизмов быстрого, но однократного действия, таких как нематоцисты в щупальцах медуз. Примечательно, что в основе этого сокращения, по-видимому, лежит молекулярный механизм, отличный от работы привычных цитоскелетных структур (таких как актиновые филаменты и микротрубочки). Процесс запускается ионами кальция и не требует непосредственного участия АТФ (от аденозинтрифосфат) или ГТФ (от гуанозинтрифосфат). Таким образом, Spirostomum представляет собой уникальную модельную систему для изучения физических пределов генерации механической энергии биологическими компонентами — от молекулярного до организменного уровня.
Нетипичные цитоскелетные структуры, обеспечивающие сокращение Spirostomum и родственных им инфузорий, называются мионемами. Мионемы представляют собой протяженные волокнистые сети в кортексе, которые сокращаются в ответ на воздействие ионов кальция. Считается, что именно они отвечают за укорочение клетки. Хотя их свойства изучены еще не до конца, результаты проведенных ранее электронно-микроскопических исследований выявили наличие волокнистых пучков, которые в процессе сокращения меняют свой внешний вид и становятся более плотными.
Хотя актомиозин обеспечивает многие виды биологических сокращений, в мионемах он обнаружен не был. Вместо этого мионемы богаты центрином и крупными гомологами его партнера по связыванию — белка Sfi1. Присутствие центрина и Sfi1 в мионемах столь же неожиданно, как и отсутствие актомиозина, поскольку гомологичные белки в других системах выполняют совершенно иные функции. У Saccharomyces cerevisiae филаменты, состоящие из центрина и Sfi1, образуют преимущественно линейную структуру, которая, возможно, служит «молекулярной линейкой» при формировании полярного тельца веретена. Известны случаи сокращения структур на основе центрина под действием кальция — например, в исчерченных жгутиковых корешках водорослей, где центрин и был впервые открыт. Однако, несмотря на предположения, основанные на этих ранних данных, филаменты центрина/Sfi1 у S. cerevisiae не проявляют признаков излома, изгиба или скольжения даже при миллимолярных концентрациях ионов кальция. Таким образом, молекулярный механизм, посредством которого центрин и Sfi1 у инфузорий связывают приток кальция с генерацией механического усилия, остается неясным.
Наряду с мионемами, ключевым компонентом кортикального цитоскелета Spirostomum были определены микротрубочки, хотя их возможная роль в процессах сокращения и/или повторного удлинения клетки пока неясна. Кортикальные микротрубочки располагаются у поверхности Spirostomum, образуя взаимосвязанные пучки вдоль рядов базальных телец. Согласно ранее предложенным моделям, физическая связь между мионемами и микротрубочками могла бы обеспечивать передачу усилий без взаимного проскальзывания или же антагонистическое действие этих структур могло бы поддерживать повторяющиеся циклы сокращения и удлинения. Тем не менее характер взаимодействия микротрубочек и мионем, а также их вклад в механические изменения формы организма, остаются во многом невыясненными.
Одной из сложностей при попытке полностью понять механизм сокращения Spirostomum является необходимость описания процессов, охватывающих широкий диапазон пространственных и временных масштабов, а также различных уровней силового воздействия. Недавно ученые измерили динамику сокращения и использовали полученные данные для построения одномерной модели распространения сигнала к началу сокращения по всему организму. Однако полная модель сокращения Spirostomum должна описывать не только динамику запуска процесса, но и то, как молекулярные события генерируют и направляют силу, вызывая соответствующие изменения трехмерной формы клетки. В данной работе ученые попытались создать такую модель, применяя подход, охватывающий все уровни организации — от молекулярного до уровня целого организма. Ученые проводим количественную характеристику структурных перестроек в мионеме и организме в целом методами световой и электронной микроскопии. Эти данные, в свою очередь, служат основой для создания вычислительных моделей сокращения, описывающих процесс как на молекулярном уровне, так и в более крупном масштабе (с использованием моделей с пониженной детализацией). Кроме того, ученые продемонстрировали способность комплекса центрин/Sfi1 из Spirostomum к сокращению в экспериментах in vitro с использованием рекомбинантных белков.
Результаты исследования
Иммунофлуоресцентная микроскопия Spirostomum
Изображение №1
Структурные изменения, сопровождающие сокращение, могут дать информацию о механизмах генерации силы, а также о последующем накоплении и диссипации механической энергии. Варьируя условия фиксации, можно зафиксировать клетки в вытянутом (длина 884 ± 111 мкм, N = 7) или сокращенном (длина 306 ± 32 мкм, N = 12) состоянии. Такое трехкратное (в среднем) уменьшение длины сопровождается увеличением диаметра с 89 ± 10 мкм (N = 7) до 117 ± 11 мкм (N = 12). С помощью иммунофлуоресцентной микроскопии были визуализированы сопутствующие изменения микротрубочек, мембраны и центрина (1A). Каждая из этих структур претерпевает значительные, но специфические перестройки в ходе сокращения.
Кортикальные микротрубочки образуют длинные спиральные структуры, шаг которых изменяется в процессе сокращения (1B). Количественный анализ показывает, что средний угол наклона витка (α) в вытянутом состоянии составляет 64° ± 3°, а в сокращенном — 34° ± 2°. Однако из-за одновременного изменения диаметра организма радиус кривизны этих пучков практически не меняется, несмотря на изменение шага спирали. По оценкам ученых, в отличие от вклада изгиба микротрубочек в удлинение «шеи», недавно описанного для Lacrymaria olor, изгиб микротрубочек у Spirostomum, по-видимому, не играет существенной роли ни в противодействии сокращению, ни в обеспечении процесса удлинения.
Далее ученые визуализировали организацию мембраны удлиненных и сократившихся клеток с помощью красителя плазматической мембраны CellMask Orange (1A). Анализируя Z-стеки изображений, было установлено, что при сокращении мембрана изгибается, образуя складки (1C). Ученые провели количественную оценку этих складок, визуализируя их в поперечном сечении (вставка на 1A) и рассчитывая коэффициент упаковки (pf), определяемый как отношение длины контура поверхности к расстоянию между ее крайними точками. Измеренные значения pf составили 1.14 ± 0.03 для удлиненных клеток Spirostomum и 2.20 ± 0.07 для сократившихся. Это свидетельствует о том, что в сократившихся клетках на единицу длины приходится вдвое больше мембраны, чем в удлиненных. Полученное значение коэффициента упаковки согласуется с гипотезой о сохранении общей площади поверхности мембраны в процессе сокращения: образование складок позволяет уменьшить эффективную площадь поверхности организма, обеспечивая резервное хранение избытка мембраны по мере его сжатия. Оценка энергии, запасаемой при изгибе мембраны в ходе сокращения, показала, что она составляет ~100 фДж — величина, пренебрежимо малая для того, чтобы оказывать существенное влияние на механику системы в целом.
Наконец, ученые визуализируем структуру мионем как в сокращенных, так и в удлиненных клетках, используя окрашивание антителами 20H5 к центрину (1A). В качественном соответствии с результатами предыдущих исследований, наблюдалась сеть плотно упакованных пучков в форме параллелограммов, покрывающих всю поверхность клетки — как в удлиненном, так и в сокращенном состоянии (1A и 1D). Количественный анализ их размеров (1D) показывает, что при переходе от удлиненной формы к сокращенной происходит уменьшение латерального размера (a) на 30% (с 3.6 ± 0.2 мкм до 2.8 ± 0.1 мкм) и продольного размера (b) на 24% (с 3.7 ± 0.3 мкм до 2.8 ± 0.1 мкм). Сокращение мионем сопровождается сдвиговой деформацией каждого отдельного параллелограмма, при которой угол при вершине (θ) увеличивается с 58.8° ± 2.9° до 68.4° ± 2.8°. Ученые также подтвердили полученные ранее данные о том, что центрин и Sfi1 колокализуются в мионеме. Используя измеренные геометрические параметры и масштабируя результаты предыдущих измерений суммарной сократительной силы на уровне всего организма, ученые оценили, что каждая единица мионемы (т. е. каждый пучок, образующий сторону параллелограмма) должна генерировать силу величиной около 1000 пН в процессе сокращения.
Крупнозернистая модель мионемной сети
Изображение №2
Для построения механического описания сокращения Spirostomum на уровне целого организма ученые разработали укрупненную сеточную модель кортикального цитоскелета (схема выше). Эта модель позволяет понять механический вклад элементов цитоскелета, выявленных с помощью иммунофлуоресценции. Ученые представили систему мионем в виде четырехугольной сетки, охватывающей тело цилиндрической формы с закругленными концами (2A). Такой подход позволяет учесть факторы сохранения объема и изменения общей формы организма. Ребра четырехугольной элементарной ячейки рассматриваются как гармонические пружины, равновесная длина которых в процессе сокращения уменьшается в определенное число раз. Для моделирования сокращения ученые численно минимизировали целевую функцию полной энергии относительно конфигурации сетки при новых значениях равновесной длины. Поскольку результаты предыдущих измерений потоков окружающей среды не указывают на значительный выброс жидкости во время сокращения, ученые исходили из допущения о сохранении общего объема. Для соблюдения этого условия была выполнена триангуляция поверхности путем разделения каждой четырехугольной ячейки сетки на две части и дополнения целевой функции энергии жестким квадратичным штрафом за отклонение от исходного объема. Чтобы учесть возможный механический вклад микротрубочек, ученые также ввели дополнительный член, описывающий торсионную пружину, который создает штраф за раскручивание соседних слоев. Таким образом, функция полной энергии отражает баланс между локальными упругими штрафами (связанными с нитями мионем и микротрубочками) и строгим глобальным ограничением, требующим отсутствия изменений объема.
Было установлено, что «широтная» сетка требует дополнительной подстройки параметров и даже при использовании их оптимального набора (включающего учет сопротивления кручению) не позволяет удовлетворительно воспроизвести экспериментально измеренные изменения структуры сетки (2C–2E). Напротив, показано, что сокращение структуры типа «рыболовная сеть» позволяет количественно воспроизвести экспериментальные данные об изменениях длин сторон элементарных ячеек (1D и 2D), углов ячеек (1D и 2E) и угла наклона спирали (1B и 2E). Примечательно, что такое соответствие достигается без учета сопротивления микротрубочек кручению. Наблюдаемое соответствие сохраняется в широком диапазоне коэффициентов сокращения для обоих наборов мионемных нитей. В целом, модель указывает на то, что структура типа «рыболовная сеть» является ключевым фактором, определяющим наблюдаемое в эксперименте сокращение, что позволяет объяснить изменения структуры элементарной ячейки и угла наклона спирали.
Исследование пучков мионем методом ПЭМ
Изображение №3
Для изучения структурных изменений в мионемах, обеспечивающих процесс сокращения, мы провели исследования методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ или TEM от transmission electron microscopy) на клетках Spirostomum, обработанных и не обработанных EGTA. Эти условия позволяют зафиксировать клетки соответственно в удлиненном или сокращенном состоянии (снимки выше). Сравнение этих двух состояний дает представление о молекулярных и структурных основах сокращения на различных масштабных уровнях. Ученые также использовали метод иммунозолотого мечения для идентификации мионем на ПЭМ-снимках и определения локализации центрина и белка Sfi1 в составе мионем на данном масштабном уровне.
Как в удлиненных, так и в сокращенных клетках антитела к центрину (20H5) плотно и специфически окрашивают мионему, а также центрин, локализованный в базальных тельцах и некоторых дополнительных кортикальных структурах (3A и 3B). В удлиненных клетках наблюдается рыхлая сеть филаментов, проходящих через мионему (3A). Остается неясным, соответствуют ли участки дополнительного окрашивания в кортексе другим структурам, содержащим центрин, или же это результат неспецифического связывания антител 20H5. В сокращенных клетках пучки очень плотные, и их субструктуру невозможно различить на снимках, полученных методом просвечивающей электронной микроскопии (3A), что согласуется с ранее полученными данными. Как в удлиненных, так и в сокращенных клетках сигнал, соответствующий центрину, распределен примерно равномерно по всей мионеме, что подтверждает роль этого белка как одного из основных компонентов мионемы (3A). Для выявления Sfi1 ученые использовали пептидные антитела, полученные к последовательностям белка родственной инфузории Stentor. Вполне ожидаемо, что эти антитела к Sfi1 обладали более низким сродством к белку Spirostomum, однако все же давали слабое окрашивание мионем, что соответствовало наблюдениям в этом труде и результатам предыдущих исследований методом иммунофлуоресценции.
Как в удлиненных, так и в сокращенных клетках на срезах, проходящих через волокно, наблюдается связь между микротрубочками и мионемами в области базальных телец (3C). Предположение о таком прямом взаимодействии мионем с базальными тельцами высказывалось ранее, а само явление было описано в одной из предыдущих работ. В данном исследовании ученые обнаружили, что в этот процесс вовлечены и кортикальные пучки микротрубочек, при этом взаимодействующие микротрубочки часто демонстрируют иммунозолотое мечение на центрин. Это позволяет предположить, что центрин может играть роль не только в формировании структуры филаментов, но и в прикреплении мионем к другим кортикальным структурам, обеспечивая распределение механического усилия и поддержание структурной организации в процессе сокращения (снимок 3 на 3A).
Ученые измерили ширину пучков в растянутом и сокращенном состояниях и обнаружили ее уменьшение в 3 раза (3D): с 0.61 ± 0.06 мкм у растянутых пучков до 0.20 ± 0.03 мкм у сокращенных. Кроме того, ученые определили плотность иммунозолотых меток и зафиксировали ее увеличение в 8 раз (3D): со 116 ± 23 меток/мкм2 в растянутых клетках до 913 ± 154 меток/мкм2 в сокращенных клетках. Таким образом, наблюдаемые структурные изменения на наноуровне согласуются с представлением о том, что перестройки мионем обеспечивают сокращение организма в целом.
Микроструктурная организация удлиненной мионемы
Изображение №4
Сетчатые структуры, наблюдаемые внутри пучков мионем у удлиненных особей Spirostomum, обработанных EGTA, демонстрируют определенную упорядоченность, которая была охарактеризована с помощью полуавтоматического анализа скелетизации (4A). Затем ученые обрабатывали полученные скелетизированные изображения для выявления точек пересечения и ветвления (4B). Хотя значительные вариации (вероятно, обусловленные тем, что филаменты входят в плоскость среза и выходят из нее) ограничивают точность скелетизации, количественный анализ показывает, что основной угол в точках соединения составляет от 100° до 135°, а большинство узлов объединяют три элемента, что соответствует структуре, близкой к гексагональной сетке (4C). В этой разветвленной структуре визуально отмечается множество протяженных, непрерывных нитей, проходящих вдоль длинной оси пучка мионем. Хотя эта структура несколько отличается от описанной в предыдущих исследованиях, в данных экспериментах использовалась более высокая концентрация EGTA при меньшей продолжительности воздействия, что могло способствовать переходу мионемы в более расслабленное состояние. Эти длинные нити могут представлять собой отдельные филаменты белка Sfi1 (GSBP1/2) Spirostomum, длина которых, согласно прогнозам, может достигать нескольких микрометров.
Сравнивая распределение длин скелетизированных филаментов в каждой ветви с расстоянием между их концами, ученые оценили их персистентную длину (4D). Исходя из предположения о незначительном влиянии внешних сил на удлиненную мионему, ученые применили модель «червеобразной цепи» (WLC от worm-like chain), в которой персистентная длина P определяется как характерное расстояние, на котором направление филамента перестает коррелировать с самим собой, т. е. < t(u)·t(s) > = e⁻|u−s|/P, где t — касательный вектор вдоль полимера, а u и s — координаты вдоль полимера. Согласно этой модели, расчетное значение персистентной длины составляет 96 ± 1 нм. Это значение согласуется с гипотезой о том, что данные филаменты могут представлять собой отдельные спирали Sfi1, связанные с центрином. Полученная оценка близка к результатам измерений для стабилизированного кальмодулином рычажного плеча миозина V, персистентная длина которого составляет 150 нм и которое имеет общее структурное сходство с комплексом Sfi1–центрин.
Моделирование молекулярной структуры
Изображение №5
Хотя полный биохимический состав мионемы до конца не установлен, к числу известных компонентов, присутствующих как у Spirostomum, так и в родственных системах, относятся центрин и гомологи белка Sfi1. У S. cerevisiae длинный альфа-спиральный белок Sfi1 (молекулярная масса 110 кДа) образует каркас, содержащий до 24 сайтов связывания центрина (длиной примерно 23–36 аминокислотных остатков каждый), что приводит к формированию нитевидных структур за счет взаимодействий типа «центрин–центрин». Чтобы понять, каким образом гомологичные компоненты могли адаптироваться для обеспечения молекулярной основы сократительных нитей мионем у S. ambiguum, ученые сначала проанализировали их аминокислотные последовательности и смоделировали структуру с помощью программы AlphaFold (5A).
Клетки S. ambiguum подвергли обработке для выделения кортикального цитоскелета и обогащения фракции мионемных белков. Белки в полученных препаратах разделили методом гель-электрофореза, после чего вырезали соответствующие белковые полосы для масс-спектрометрического анализа. Ученые идентифицировали предполагаемые последовательности белков центрина и Sfi1, используя данные транскриптома S. ambiguum, депонированные в базе данных NCBI. Было обнаружено несколько белков, содержащих множественные тандемные повторы последовательности длиной 69 аминокислотных остатков, сходной с таковой у Sfi1-подобных белков, связывающих центрин, у Paramecium tetraurelia, а также два белка центрина, наличие которых подтверждается данными масс-спектрометрии выделенных мионем. Несмотря на то, что идентифицированные прочтения из депонированных данных транскриптома относительно короткие, повторы длиной 69 аминокислот демонстрируют высокую степень гомологии с белками GSBP1 и GSBP2 (Giant Spasmin Binding Proteins — гигантские белки, связывающие спазмин), недавно выявленными у Spirostomum minus; эти белки содержат множество тандемных повторов консенсусной последовательности и имеют огромную молекулярную массу (до 2000 кДа), превышающую массу белка Sfi1 из S. cerevisiae более чем в 20 раз. Для дальнейшего анализа с применением программы AlphaFold и метода реконструкции in vitro были отобраны репрезентативные мотивы Sfi1 и репрезентативный белок центрина.
Эти последовательности демонстрируют, что организация белка Sfi1 у Spirostomum существенно отличается от структур, ранее описанных у S. cerevisiae. Выявленные у Spirostomum Sfi1-подобные белки содержат множество идущих подряд повторов длиной 69 аминокислотных остатков с минимальным количеством вставок, не относящихся к повторам. Таким образом, расположение предполагаемых сайтов связывания центрина характеризуется высокой регулярностью на значительной части длины белка. Кроме того, последовательность этих повторов отличается от канонического повтора Sfi1 у S. cerevisiae и других родственных эукариот. Во-первых, каждый повтор длиной 69 аминокислотных остатков у Spirostomum содержит два остатка пролина. В то же время в белке Sfi1 у S. cerevisiae остатков пролина относительно немного. Эти остатки пролина разделяют повтор длиной 69 аминокислотных остатков на два субповтора длиной 36 и 33 аминокислотных остатка. Во-вторых, в каждом выявленном у Spirostomum повторе Sfi1 присутствует высококонсервативный остаток триптофана, тогда как в повторах Sfi1 у S. cerevisiae этот остаток выражен менее консервативно.
Для анализа структурных последствий этих особенностей последовательности ученые использовали AlphaFold, чтобы предсказать структуру участка из 15 повторов белка Sfi1 из S. Ambiguum и сопоставимого числа повторов белка Sfi1 из S. cerevisiae (5A). Предсказанная с помощью AlphaFold структура повторов Sfi1 из S. ambiguum содержит значительно больше изломов внутри самих повторов по сравнению с Sfi1 из дрожжей S. cerevisiae (5A). Эти нарушения непрерывности протяженной альфа-спирали возникают вблизи аминокислотных остатков, способствующих разрыву спирали, — таких как упомянутые выше остатки пролина, а также остатки глицина. Данные различия указывают на то, что длина персистентности повторов, подобных Sfi1 из S. ambiguum, существенно меньше, чем у повторов Sfi1 из S. Cerevisiae.
Хотя эти данные не дают окончательного ответа, они указывают на модель сокращения, согласно которой связывание центрина с ионами кальция и их высвобождение могут регулировать образование и стабилизацию изгибов (не наблюдаемых у дрожжевого белка Sfi1), тем самым стабилизируя либо более вытянутое, либо более компактное состояние крупного белка Sfi1. Ученые попытались проверить эту модель, сравнив структуры Sfi1, предсказанные программой AlphaFold для условий с наличием и отсутствием кальция. Хотя AlphaFold позволяет получить как вытянутые, так и компактные структуры Sfi1 в обоих случаях, модели AlphaFold смещены в сторону конечных олигомеров с фиксированным числом цепей и симметрией точечной группы — как из-за особенностей обучающей выборки PDB, так и вследствие заложенных в программу архитектурных допущений. В результате они менее эффективны при моделировании спиральных ансамблей, требующих наличия винтовой симметрии и периодической трансляции. В связи с этим ученые обратились к экспериментам по реконституции.
Реакция белковых комплексов мионем in vitro в ответ на воздействие кальция
Хотя сам по себе AlphaFold не дает исчерпывающих доказательств сокращения комплекса центрин/Sfi1 у Spirostomum, полученные с его помощью предсказания позволили предположить, что укороченные комплексы центрин/Sfi1 могут уплотняться в ответ на кальций, что, в свою очередь, обеспечивает сокращение мионем. Кроме того, ученые выдвинули гипотезу, согласно которой сокращение мультифиламентных комплексов на мезомасштабном уровне может происходить за счет мультимеризации или фазового разделения — процессов, также регулируемых кальцием и способных переводить длинные филаменты Sfi1 в более компактное состояние. Ученые поставили задачу воспроизвести комплекс центрин/Sfi1 мионем in vitro, чтобы экспериментально проверить обе эти гипотезы.
Для этого ученые провели совместную экспрессию в клетках E. coli двух конструкций: одной, содержащей три тандемных повтора Sfi1 из Spirostomum (по 69 аминокислотных остатков каждый) — которую назвали Sfi1x3, — и второй, кодирующей центрин S. ambiguum (далее именуемый просто «центрин»). Конструкция Sfi1x3 была фланкирована SH3-доменом и лигандом, что повысило выход продукта при очистке; кроме того, обе конструкции содержали His-метку для выделения белков (5A). Экспрессия этих белков протекала эффективно, и ученым удалось успешно выделить комплекс с использованием Ni-NTA-смолы. Повышенный выход продукта при совместной экспрессии может указывать на то, что в составе комплекса эти белки более стабильны, менее склонны к агрегации или обладают меньшей токсичностью. Помимо увеличения выхода, наличие SH3-домена и лиганда позволяет формировать более длинные филаменты из повторов Sfi1, подобные нативным структурам GSBP1/2. Затем была охарактеризована активность комплекса в ответ на ионы кальция in vitro методом аналитического ультрацентрифугирования (AUC от analytical ultracentrifugation), а также исследованы более крупные мультимеры с помощью флуоресцентной микроскопии.
Ученые охарактеризовали отдельные комплексы методом аналитического ультрацентрифугирования (AUC) в условиях высокой ионной силы (1 М NaCl), чтобы предотвратить образование крупных агрегатов. Использовались два подхода: метод установления равновесия (в котором для определения массы уравновешиваются силы диффузии и центробежные силы) и метод измерения скорости седиментации (позволяющий оценить гидродинамическое сопротивление и связать наблюдаемые различия с изменениями массы или формы комплекса). Измерения, проведенные в отсутствие кальция, показали, что молекулярная масса комплекса составляет 121.8 ± 4.0 кДа. Этот результат лучше всего согласуется с составом, включающим 4 молекулы центрина (по 20.9 кДа каждая) и одну молекулу Sfi1x3 (36.6 кДа). Хотя нельзя уверенно утверждать, что данный очищенный комплекс сохраняет нативную стехиометрию, полученные данные согласуются с моделью, предполагающей связывание 1–2 молекул центрина с каждым повтором Sfi1 у Spirostomum, что предсказывалось на основе сравнения с белком Sfi1 дрожжей.
Затем ученые повторили это измерение, добавив 10 мМ CaCl2, и обнаружили очень схожий основной компонент с массой 121.4 ± 3.0 кДа. Это свидетельствует об отсутствии изменений массы при переходе от одних условий к другим, которые могли бы указывать на изменение характера связывания центрина и Sfi1. Кроме того, ученые провели эксперимент, в ходе которого вычли данные, полученные в одних условиях, из данных, полученных в других (для одного и того же радиуса), и получили практически ровную линию: незначительные различия наблюдались лишь в области наибольших масс, но не для основного компонента. Также был выявлен вторичный компонент с массой 830.5 ± 424.5 кДа (в отсутствие кальция) и 901.7 ± 247.5 кДа (в присутствии кальция). При этом анализ разности данных показал небольшое увеличение массы более тяжелого компонента. Однако, поскольку доля этих крупных комплексов в общей массе образца невелика (15% и 13% в отсутствие и в присутствии кальция соответственно), в дальнейшем анализе ученые сосредоточились преимущественно на основном компоненте.
Далее ученые использовали метод аналитического ультрацентрифугирования (AUC) в режиме седиментации (определения скорости осаждения) для оценки гидродинамического сопротивления и проверки того, происходит ли компактизация отдельных комплексов. Результаты эксперимента показали, что, хотя масса комплексов в обоих образцах оставалась практически неизменной (что свидетельствует об отсутствии изменений стехиометрии), образец с добавлением кальция осаждался значительно быстрее. Это указывает на компактизацию комплекса в присутствии кальция (5C). На основе полученных данных ученые определили коэффициенты седиментации и усреднили результаты двух независимых серий подготовки образцов (по три запуска AUC для каждой), выявив статистически значимое различие в измеренных значениях коэффициента седиментации (5D). Эти данные убедительно свидетельствуют о том, что под действием кальция отдельные комплексы центрин/Sfi1 уменьшаются в размерах (становятся более компактными). Предполагается, что этот процесс может быть одним из механизмов, обеспечивающих сокращение мионем.
Наконец, ученые исследовали изменения более крупного масштаба в межкомплексных взаимодействиях, которые могут приводить к увеличению плотности пучков в процессе сокращения (подобно тем, что показаны на изображении №3). Для этого ученые использовали флуоресцентную метку для очищенного белка и проводили визуализацию методом широкопольной флуоресцентной микроскопии. Было обнаружено, что при повышенной концентрации кальция образуется значительно больше очень плотных точечных скоплений. Это резко контрастировало с условиями низкой концентрации кальция и контрольными образцами, где образование таких скоплений было минимальным, а распределение белка — более равномерным. Для количественной оценки этих различий были построены гистограммы распределения значений интенсивности пикселей. Они продемонстрировали тенденцию к смещению в сторону более экстремальных значений по мере повышения концентрации кальция. Данное изменение свидетельствует о переходе от состояния белка в растворе к образованию крупномасштабных агрегатов (5E), который начинается при физиологически значимой концентрации 100 мкМ. Примеры наиболее крупных агрегатов, характерных для каждого из исследованных условий, представлены на 5F. В совокупности полученные in vitro данные позволяют предложить фазовую диаграмму (5G), согласно которой повышение концентрации кальция стимулирует как компактизацию отдельных Sfi1-повторов, связывающих центрин, так и их самоассоциацию (вероятно, обусловленную взаимодействиями между молекулами центрина), что, в свою очередь, приводит к дальнейшей компактизации филамента в целом.
Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых и дополнительные материалы к нему.
Эпилог
В рассмотренном нами сегодня труде ученые детально исследовали гигантскую одноклеточную инфузорию Spirostomum, способную стремительно сокращаться, уменьшаясь в длину с ~1 мм до ~300 мкм всего за 5 мс. Ученые хотели понять механизм такого разительно быстрого изменения формы организма.
Spirostomum ambiguum — это гигантская одноклеточная инфузория, получившая свое название благодаря кайме из волосовидных ресничек, с помощью которых она плавает. Среди других инфузорий она выделяется способностью сокращаться со скоростью, достигающей примерно 100 длин собственного тела в секунду, и быстро повторять это движение. Ученые полагают, что такое поведение помогает организму спасаться от хищников или взаимодействовать с другими инфузориями.
Мышечные волокна человека способны сокращаться в сопоставимых пропорциях, однако этот процесс занимает примерно в 10 раз больше времени. Именно это различие сделало Spirostomum особенно интересным объектом для исследователей, стремящихся понять механизм, обеспечивающий столь высокую скорость.
Используя методы электронной и иммунофлуоресцентной микроскопии, ученые детально изучили Spirostomum. Они обнаружили, что запуск сокращения инициируется ионами кальция, а само движение осуществляется благодаря необычной структуре, напоминающей рыболовную сеть.
В отличие от животных, у одноклеточных организмов, таких как Spirostomum, нет мышечных волокон. Вместо них они содержат волокнистые структуры, называемые мионемами. Эти структуры состоят из кальций-связывающих белков — центрина и Sfi1. У Spirostomum мионемы образуют сеть, похожую на рыболовную, которая охватывает организм снаружи. При начале сокращения эта сеть стягивается внутрь, а затем возвращается в исходное состояние.
Для накопления и высвобождения энергии, необходимой для сокращения, человеческие мышцы используют аденозинтрифосфат (АТФ). Spirostomum, по-видимому, опирается на принципиально иной процесс. Как отмечают ученые, сравнивать сокращение наших мышц с работой Spirostomum — это все равно что сравнивать бензиновый двигатель с электрическим. АТФ претерпевает химические изменения и “сгорает”, подобно бензину, тогда как ионы кальция действуют подобно электрическому току. Однако, до сих пор неизвестно, что именно создает напряжение, запускающее этот ток, и как система “сбрасывается” для повторного сокращения.
Способность к такому «сбросу» остается одним из главных нерешенных вопросов. Теперь исследователи хотят точнее выяснить, как кальций инициирует сокращение и как организм готовится к повторению этого процесса. Полученные результаты могут дать ценные подсказки инженерам, работающим над созданием искусственных мышц, способных к быстрому движению без использования АТФ. Изучая, как Spirostomum многократно запускает и «перезагружает» свою систему сокращения, работающую на ионах кальция, исследователи надеются выявить принципы, которые можно будет применить при создании синтетических устройств.
Немного рекламы
Спасибо, что остаетесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).
Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Maincubes Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 - 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB - от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?