За промежуток чуть более века электронный микроскоп превратился из инструмента, едва способного различать вирусные частицы, в устройство, способное фиксировать детали строения атомов

Биологические структуры существуют в широком диапазоне масштабов. На одном конце находятся целые организмы, размеры которых варьируются от бактерий, диаметр которых составляет всего несколько микрометров, до млекопитающих, размеры которых измеряются в метрах.

Одним из самых маленьких известных цельных организмов является бактерия Mycoplasma genitalium, размер которой составляет примерно 200 нм. Напротив, сеть мицелия Armillaria ostoyae в национальном лесу Малхер в Орегоне, возможно, является самым большим живым организмом, занимая площадь почти 10 кв.км. и веся около 35 000 тонн.

Эти организмы можно увидеть невооружённым глазом или с помощью простых световых микроскопов, которые используются с середины 1600-х годов. На другом конце спектра находятся атомы, аминокислоты и белки, размер которых колеблется от нанометров до их десятых долей (ангстремов).

Наблюдение молекул в таком маленьком масштабе позволяет нам разгадать тончайшие механизмы жизни: как отдельные нейроны соединяются и взаимодействуют, как рибосомный механизм преобразует генетический код в белки или как вирусы, такие как ВИЧ, проникают в клетки-хозяева и захватывают их. Изучение мелких структур, будь то двойная мембрана хлоропласта, белковая оболочка бактериофага или ветвистая архитектура синапса, обеспечивает связь между атомными деталями и физиологией всего организма, перекидывая мостик от формы к функции.

Возможность исследовать и картографировать такие крошечные механизмы была недоступна учёным до изобретения электронного микроскопа. Разработанный в 1930-х годах, он обещал теоретическое разрешение порядка ангстремов (10^-10 м), что почти в сто раз превосходило возможности самого совершённого светового микроскопа того времени. В 1931 году Эрнст Руска и его научный руководитель Макс Кнолл, работавшие в Техническом университете Берлина, разработали первый прототип, заменив стеклянные линзы электромагнитными катушками для фокусировки пучков электронов вместо света.

Этот первый прибор по разрешению едва превосходил лупу. Но в течение следующего столетия усовершенствования в конструкции, подготовке образцов и вычислениях превратили электронный микроскоп в незаменимый инструмент современной биологии.

К 1938 году учёные впервые с помощью электронного микроскопа сфотографировали вирус — ортопоксвирус эктромелии мышей.

Год спустя, в 1939 году, Густав Кауше, Эдгар Пфанкух и Хельмут Руска представили первые изображения вируса мозаики табака (TMV). Хотя TMV часто называют «первым» вирусом, изображённым с помощью электронного микроскопа, поскольку TMV был классическим модельным вирусом в биологии и его палочковидная форма была сразу узнаваема, микрофотографии ортопоксвируса мыши технически появились раньше.

А сегодня современная криоэлектронная микроскопия, при которой образцы перед визуализацией замораживаются в жидком этане, позволяет различать отдельные атомы в белках. Во время пандемии COVID-19 криоэлектронная микроскопия позволила обнаружить белок-шип в вирусе SARS-CoV-2, что непосредственно повлияло на разработку вакцин от COVID. Эта техника также позволила обнаружить белковый рецептор, который воспринимает тепло и боль, продемонстрировав, как он передаёт физические сигналы в нашу нервную систему. Это прорывное открытие было удостоено Нобелевской премии по физиологии 2021 года.

Несмотря на то, что электронные микроскопы позволяют нам чётко видеть всё более мелкие структуры, проблемы остаются. Одно из них заключается в том, что изображения по-прежнему ограничены статичными моментальными снимками. Поскольку образцы необходимо снимать в вакууме, невозможно непосредственно наблюдать динамику живых клеток.

Чтобы обойти эту проблему, учёные фиксируют динамику косвенно, замораживая образцы на разных этапах процесса (например, во время сборки белкового комплекса), а затем восстанавливают последовательность из этих статических кадров.

Кроме того, образцы должны быть чрезвычайно тонкими, чтобы электронный пучок мог проходить через них, что не позволяет снимать толстые ткани. И, наконец, помимо этих биологических ограничений, электронные микроскопы имеют большие габариты, могут стоить миллионы долларов и требуют специальных помещений, обучения и опыта для работы с ними.

Несмотря на эти ограничения, электронная микроскопия остаётся мощным инструментом в биологии, соединяющим масштабы молекулярной структуры и жизненных функций. История её открытия — это история упорной изобретательности, в которой участвовало множество людей и произошло множество прорывов, которые помогли создать современный электронный микроскоп.

Семена идеи

К концу XIX века биологи понимали, что приближаются к пределу разрешения светового микроскопа. В своём стремлении увидеть биологические объекты в более мелких деталях они достигли барьера, который свет не мог преодолеть.

Доказательство этого было получено Эрнстом Аббе, профессором экспериментальной физики и математики Йенского университета в Германии. До Аббе конструкция микроскопов была скорее искусством, чем наукой, и новаторы создавали оптические приборы методом проб и ошибок. Карл Цейсс, который начал производить микроскопы в 1850-х годах, в 1866 году обратился к Аббе с предложением использовать его научные знания для создания микроскопов. Вместе они начали разрабатывать инструменты для улучшения однородности и качества оптических линз.

В начале 1870-х годов, работая над объективами микроскопа (линзами, расположенными ближе всего к образцу в микроскопе), Аббе обнаружил, что чёткость изображения зависит не только от того, насколько идеально отшлифована линза, но и от того, сколько дифрагированного света от образца может уловить линза. Он понял, что мелкие детали в образце преломляют свет под широким углом, и только объективы с достаточно большим отверстием могут собирать эти лучи, чтобы сфокусировать изображение.

Исходя из этого открытия, Аббе определил понятие «числовая апертура» (мера того, сколько света может собрать линза). Числовая апертура NA = n sin θ, где n — показатель преломления среды, а θ — полуугол самого широкого конуса света, который может принять линза.

Он показал, что мельчайшая видимая деталь ограничена длиной волны света, делённой на удвоенный размер детали. Значение удваивается, поскольку мелкие структуры в образце дифрагируют свет в симметричные лучи по обе стороны от оптической оси. Когда оба этих луча улавливаются объективом и сходятся в плоскости изображения, они мешают воссозданию чередующихся светлых и тёмных узоров, которые представляют мелкие детали образца.

Формула Аббе предназначена для когерентного проходящего света, а не для флуоресцентной визуализации. В флуоресцентной микроскопии каждая молекула излучает свет независимо, а не путём интерференции волновых фронтов, поэтому изображение не формируется путём наложения дифракционных порядков. Вместо этого разрешение ограничивается функцией рассеяния точки микроскопа, описываемой критерием Рэлея (d = 1,22 λ / 2 NA), который устанавливает наименьшее расстояние, на котором можно различить два флуоресцентных излучателя.

Даже с ультрафиолетовым светом, находящимся на коротком конце видимого спектра (400 нанометров), предел разрешения составлял 200 нанометров — больше, чем у большинства вирусов, внутриклеточных структур и белковых комплексов.

Надежда на разрешение структур ниже этой границы разрешения появилась только в 1895 году, когда немецкий физик Вильгельм Рентген открыл рентгеновские лучи, форму высокоэнергетического электромагнитного излучения с длинами волн короче, чем у ультрафиолетового света, и опубликовал (ныне культовое) изображение руки своей жены Берты, на котором были чётко видны её кости и обручальное кольцо. Это был первый случай, когда скрытые внутренние части тела можно было увидеть без вскрытия. Стали видны кости, суставы и даже металлические фрагменты, застрявшие внутри тела.

В период с 1913 по 1915 год британский физик Уильям Генри Брэгг и его сын Уильям Лоуренс Брэгг разработали метод, называемый рентгеновской кристаллографией. Работая с простыми кристаллами, такими как соль и алмаз, они показали, что когда рентгеновские лучи попадают на регулярную кристаллическую решётку, они дифрагируют под определёнными углами, которые показывают расстояние между атомами в кристалле. Этот метод работает, потому что рентгеновские лучи имеют длину волны, приблизительно равную размеру химических связей, что позволяет лучам достигать и отражаться от каждого атома в решётке, давая представление о структуре на атомном уровне. Применяя математическую операцию, называемую преобразованием Фурье, к этим дифракционным картинам, запечатлённым на фотопластинках, Брэгги реконструировали трёхмерное расположение атомов в кристалле.

Однако биомолекулы по своей природе не являются кристаллическими. Чтобы их изучить, их приходилось кропотливо извлекать, очищать и кристаллизовать, отделяя от окружающей среды. Рентгеновская кристаллография биомолекул началась в 1930-х годах, положив начало области структурной биологии. Благодаря разрешению в субнанометровом диапазоне изобретение рентгеновской кристаллографии произвело революцию в молекулярной биологии. Она была применена, например, для определения структуры ДНК, гемоглобина и инсулина — молекул, которые определили траекторию развития современной биологии.

Однако многие биологические объекты оставались недоступными. Вирусы редко поддавались кристаллизации, а клеточные структуры часто теряли свою целостность при извлечении из естественной среды. Таким образом, даже несмотря на то, что рентгеновская кристаллография позволяла выявлять структуры небольших белков, а световая микроскопия — визуализировать клетки, между изучением небольших молекул и целых клеток сохранялась пропасть, в результате чего большая часть биологии оставалась невидимой.

Тем временем начинал открываться доступ к параллельному миру электронов. На рубеже XX века немецкий физик Ганс Буш из Йенского университета изучал поведение электронных пучков в магнитных полях. Его работа основывалась на десятилетиях экспериментов с катодными лучами — потоками электронов, выделяющимися при подаче высокого напряжения внутрь стеклянной трубки.

Катодные лучи стали играть центральную роль как в физике, так и в технологии: физики использовали их для исследования рассеивания электронов, ионизации газов и реакции на электрические и магнитные поля, а инженеры — для создания таких устройств, как радио и телевизор. Именно в попытке лучше понять и контролировать эти лучи Буш сформулировал свои замечательные теории.

В 1926 и 1927 годах Буш опубликовал две статьи, в которых математически доказал, что магнитная катушка может фокусировать электронный пучок так же, как стеклянная линза фокусирует свет. Хотя уже было известно, что катушки могут изгибать электронные пучки, ключевым открытием Буша было то, что он описал это явление с помощью терминов из области оптики: электронные пучки можно рассматривать как лучи света. Такие понятия, как фокусное расстояние, увеличение, формирование изображения и даже аберрации линз, можно было применять к электронам. Это означало, что хорошо разработанная теория оптических систем можно было почти напрямую переносить в другие дисциплины.

Ещё до того, как были открыты электроны, Юлиус Плюккер в 1850-х годах показал, что магнитные поля могут отклонять светящуюся траекторию катодных лучей. Иоганн Хитторф (1869) и Кристиан Биркеланд (1896) независимо друг от друга использовали магнитные катушки для их фокусировки. Ганс Буш был первым, кто представил математические вычисления траекторий электронов во время этой фокусировки.

Лауреат Нобелевской премии по физике и изобретатель голографии Денис Габор позже отразил вклад Буша в лекции 1942 года: «Статья Буша была больше, чем просто откровением; она была почти как искра во взрывоопасной смеси. В 1927 году ситуация в физике была такова, что для начала настоящего всплеска творческой активности достаточно было одного только словосочетания „электронная линза“».

Итак, идея Буша дала начало электронной оптике. В течение нескольких лет по крайней мере три независимых изобретателя заявили о своих правах на создание электронного микроскопа, и все они отмечали, что их вдохновила именно первоначальная идея Буша.

Первый электронный микроскоп

В 1928 году Лаборатория высокого напряжения Технического университета Берлина (ведущий научно-исследовательский центр, специализировавшийся на электротехнике в межвоенный период) занималась исследованиями в области передачи и изоляции высокого напряжения. Постоянным препятствием были скачки напряжения, часто вызываемые грозами, которые неоднократно повреждали оборудование лаборатории. Но прежде чем учёные смогли разработать способ решения этой проблемы, им нужно было сначала понять её: когда именно происходили эти скачки напряжения и насколько быстрыми или значительными были колебания напряжения?

Для решения этой задачи лаборатория надеялась принять на работу аспиранта, который создал бы прототип высокоскоростного осциллографа — устройства, способного непосредственно визуализировать электрические импульсы. Электронно-лучевой осциллограф работал путём направления пучка электронов на фосфоресцирующий экран внутри вакуумной трубки, где при столкновении возникала яркая точка света. Электрические поля можно было использовать для отклонения пучка по горизонтали (для отображения времени) и по вертикали (для отображения амплитуды сигнала), так что электрические сигналы отображались в виде движущихся линий света, которые можно было наблюдать непосредственно.

Хотя электронно-лучевые осциллографы уже использовались, они служили в основном для регистрации более медленных сигналов. Однако высоковольтные скачки напряжения, возникающие во время гроз или коротких замыканий, пролетали за одну сотую миллисекунды, практически не оставляя следов на экране. Чтобы сделать такие мимолётные сигналы видимыми, необходимо было увеличить интенсивность электронного луча, что означало фокусировку луча в как можно более маленькую и мощную точку. Только один студент решился принять этот вызов: 21-летний Эрнст Руска.

Руска родился в семье учёных в Гейдельберге, Германия, в 1906 году. Он с раннего возраста был знаком с оптикой, так как его дядя был астрономом в местной обсерватории, а его отец, историк науки, владел большим оптическим микроскопом, к которому Руска было строго запрещено прикасаться. В своей Нобелевской лекции он вспоминает: «Мы видели на столе в другой комнате красивую желтоватую деревянную коробку, в которой хранился большой микроскоп Zeiss моего отца... Иногда он показывал нам интересные объекты под микроскопом, это правда; однако по понятным причинам он боялся, что детские руки могут повредить объектив или образец, неуклюже манипулируя грубым и линейным приводом. Таким образом, наши первые представления о ценности микроскопии нельзя было назвать строго позитивными».

В отличие от остальных членов семьи, Руска больше интересовался не наукой, а техническими проектами и решением проблем с помощью инженерии. В то время как другие дети Руски проводили выходные с отцом, классифицируя образцы горных пород или определяя голоса птиц, Эрнст предпочитал возиться с электрическими распределительными щитами и читать книгу Макса Эйта «Behind Plow and Vice» («За плугом и тисками»), мемуары об инженерии и изобретениях. Он вспоминает, что, когда стал старше, его увлекали объяснения учителя физики в старшей школе о движении электронов в электростатических полях и ограничениях световых микроскопов — интерес, который он сохранил и во взрослом возрасте.

В лаборатории высокого напряжения под руководством Макса Кнолла Руска приступил к созданию долгожданного осциллографа. В этом устройстве поступающий электрический ток проходил через вертикальные отклоняющие пластины, вызывая смещение электронного луча пропорционально амплитуде скачка напряжения. Для повышения чёткости изображения перед отклоняющими пластинами была установлена магнитная фокусирующая катушка, которая концентрировала пучок в небольшую яркую точку, прежде чем он достигал фосфоресцирующего экрана. Задача Руски состояла в том, чтобы определить оптимальное расположение этих катушек, чтобы точка была как можно более чёткой.

В качестве ориентира Руска обратился к недавним статьям Ганса Буша о линзообразном действии магнитных полей на электронные пучки. В этих работах Буш не только показал, что катушка может действовать как «магнитная электронная линза», но и вывел формулы, описывающие траектории электронов в таком поле и изменение фокусного расстояния в зависимости от тока катушки. Используя эти расчёты, Руска экспериментально подтвердил теории Буша и определил точное расположение катушек, необходимое для чёткой фокусировки пучка. Затем он поместил небольшую апертуру на пути пучка и, изменяя ток катушки, смог проецировать и записывать изображение апертуры с разным увеличением на экране.

Как позже вспоминал Руска в своей Нобелевской лекции, его магистерская диссертация 1929 года содержала «многочисленные чёткие изображения с различным увеличением апертуры анода, облучённого электронами... первые зарегистрированные электронно-оптические изображения».

К 1930 году, когда экономика Германии рухнула под тяжестью послевоенных репараций и глобальной депрессии, Руска не смог найти работу в промышленности и остался в университете для продолжения докторантуры. Поначалу не будучи уверенным в направлении своих исследований, он продолжил экспериментировать с магнитными линзами. Он рассудил, что если одна катушка может создать увеличенное изображение, то две катушки, расположенные последовательно, могут увеличить его ещё больше — так родилась концепция электронного микроскопа.

К апрелю 1931 года Руска сконструировал двухступенчатую систему визуализации с общим увеличением в 14,4 раза, что всё ещё было намного ниже примерно 1000-кратного увеличения, достигаемого высококачественными световыми микроскопами того времени. Система начиналась с катода внутри вакуумной трубки, который испускал электроны при подаче высокого напряжения. Эти электроны ускорялись в направлении анода и проходили через небольшую апертуру, образуя узкий луч, похожий на свет, проходящий через отверстие. Магнитные катушки, обёрнутые вокруг трубки, действовали как электронные линзы. Первая катушка, расположенная близко к объекту, служила объективом, фокусируя проходящие электроны и формируя промежуточное изображение. Вторая катушка, расположенная ниже по потоку, действовала как проекционная линза, перефокусируя и увеличивая промежуточное изображение, чтобы его можно было зафиксировать на флуоресцентном экране.

Тщательно настраивая ток в обеих катушках, Руска мог контролировать фокусное расстояние и достигать гораздо большего увеличения, чем с помощью одной линзы. Конечное изображение появлялось на экране в виде светящихся узоров: яркие области, где электроны проникали через образец, и тёмные области, где они поглощались или рассеивались.

Эти изображения, сфотографированные через окно в трубке, стали первыми электронными микрофотографиями, созданными путём пропускания электронов через последовательные магнитные линзы в многоступенчатой системе. Хотя по современным стандартам его разрешение было довольно скромным, этот прибор считается первым электронным микроскопом. Руска представил результаты для публикации в том же месяце, хотя статья появилась только в августе. К сожалению, без его ведома, в период между подачей и публикацией статьи другой изобретатель, Рейнхольд Рюденберг, уже подал заявку на патент на электронный микроскоп.

От паралича до первых патентов

Рюденберг, родившийся в Ганновере в 1883 году, достиг зрелости в золотое десятилетие физики, отмеченное открытием рентгеновских лучей Рентгеном, идентификацией электрона и первыми исследованиями радиоактивности. Будучи старшеклассником, он с энтузиазмом повторял многие из этих экспериментов, построив двусторонний телеграф Морзе, питая рентгеновскую трубку от индуктора с ручным заводом и сконструировав радиопередатчик и приёмник. Свой первый патент на радиоосциллятор он получил, ещё будучи студентом электротехники в Техническом университете Ганновера.

После получения докторской степени Рюденберг провёл три года (1906-1908) в Гёттингенском университете, занимаясь прикладной механикой и сотрудничая с ведущими деятелями в области теории электронов, в том числе с Гансом Бушем. В 1908 году он поступил на работу в компанию Siemens в Берлине в качестве инженера-конструктора, а к 1923 году дослужился до должности главного инженера-электрика.

Работая в Siemens, Рюденберг разработал несколько новых электрических конструкций, среди которых были системы охлаждения для высоковольтных генераторов, один из первых 60-мегаваттных турбогенераторов, проводники для высоковольтных линий электропередачи и релейные системы для удалённых электростанций. Он также три года проработал стажёром в патентном отделе Siemens, и этот опыт, несомненно, способствовал его плодотворной работе в этой области. Он был плодовитым изобретателем и, по оценкам, владел более чем сотней уникальных патентов.

Осенью 1930 года, во время отпуска, младший сын Рюденберга тяжело заболел. У трёхлетнего мальчика поднялась высокая температура и наступил паралич. Он заразился полиомиелитом. В то время, когда в Германии ежегодно заражались тысячи людей, а смертность составляла около 15%, диагноз был ужасным. Хуже того, о «микробе», ответственном за болезнь, почти ничего не было известно: не существовало ни диагностических тестов, ни лечения, ни вакцины.

«Этот удивительный факт и его значение для науки и здравоохранения не давали мне покоя», — вспоминал позже Рюденберг. «Во время многих бессонных ночей, мучимый судьбой своего сына, я мучился фантазиями о том, как найти способы исследовать эти крошечные микробы, как можно атаковать их, чтобы вылечить болезнь или хотя бы остановить её развитие. Конечно, нужно было найти средство, более тонкое, чем свет, чтобы сделать эти крошечные вирусы неизмеримого размера видимыми для человеческого глаза».

Мотивированный как отцовской заботой, так и инженерным инстинктом, Рюденберг начал искать способ увидеть такие вирусы. Он рассмотрел рентгеновские лучи, но быстро отверг их, поскольку не существовало метода, позволяющего сфокусировать рентгеновские частицы, как видимый свет. Однако вариант с электронами был многообещающим. Изучив их поведение вместе с Бушем в Гёттингене, он знал о фокусирующей способности магнитных полей, и когда Буш позже опубликовал свои статьи 1926 и 1927 годов о магнитных электронных линзах, он даже отправил копии непосредственно Рюденбергу.

Зимой 1930-1931 годов Рюденберг набросал полный концептуальный проект электронного микроскопа, подробно описав его источник электронов, электростатические линзы для фокусировки и увеличения, а также флуоресцентный экран для визуализации. В мае 1931 года, всего за неделю до того, как Руска публично представил свою работу, Рюденберг подал серию патентных заявок с описанием этого электронного микроскопа.

Тем временем, не зная о патентах Рюденберга, Руска также продолжал свои исследования. В своей докторской диссертации Руска сосредоточился на усовершенствовании электромагнитной линзы, чья способность к увеличению всё ещё значительно отставала от оптических линз обычных световых микроскопов. В то время современный световой микроскоп мог увеличивать изображения примерно в 1000 раз, тогда как в 1932 году существующие электронные микроскопы всё ещё оставались на уровне ничтожного 17-кратного увеличения.

Руска понял, что для улучшения характеристик необходимо уменьшить фокусное расстояние электронного микроскопа, поскольку более короткое фокусное расстояние сильнее изгибает пучок электронов, приводя их к меньшей фокальной точке и обеспечивая более высокое увеличение. Он обнаружил, что обёртывание катушки железом даёт потрясающий эффект. Это привело к изобретению полюсной линзы, которая сейчас является основным компонентом всех электронных микроскопов.

Полюсные элементы представляют собой цилиндры из железа, каждый с катушкой, расположенные на расстоянии нескольких миллиметров друг от друга. Узкий зазор концентрирует магнитное поле, создавая линзу с более сильной фокусирующей способностью и меньшим фокусным расстоянием. Это не только усилило увеличение, но и предоставило больше места для добавления третьей линзы (конденсорной линзы перед образцом) в колонне катодного луча.

В это время Руска и Кнолл также предприняли смелую попытку оценить теоретический предел разрешения электронного микроскопа. Они применили формулу, используемую в световой микроскопии, и заменили длину волны света длиной волны электронов. Для электронов, ускоренных до 75 киловольт (более высокое напряжение увеличивало бы энергию электронов и ещё больше сокращало их длину волны, что в принципе давало бы ещё более мелкие детали), они пришли к выводу, что предел разрешения составляет 2,2 ангстрема (2,2 x 10^-10 метра).

Эта цель была достигнута спустя 40 лет. Сегодня электронная микроскопия даже превзошла этот показатель: учёные получили разрешение биологических структур значительно ниже 2 ангстрем, в том числе ГАМК-рецептора, мембранного белкового канала, который опосредует тормозную нейротрансмиссию, с разрешением 1,7 ангстрема. В этой системе электроны были ускорены до 300 киловольт, что дало разрешение, превосходящее разрешение, предложенное Руской, при использовании всего 75 киловольт.

Руска представил свою диссертацию в середине 1933 года, а позже в том же году построил значительно усовершенствованный микроскоп, достигающий увеличения до 12 000 раз. Изображения, полученные с кусочка алюминиевой фольги, впервые превысили предел разрешения светового микроскопа (несмотря на то, что высокоэнергетический пучок сжёг образцы).

Руска заметил, что очень тонкие фольги давали более чёткие изображения с более сильным контрастом, а также дольше выдерживали воздействие луча. Он пришёл к выводу, что в тонких образцах большинство электронов проходит сквозь них, не теряя энергии, упруго рассеиваясь (дифрагируя), а не поглощаясь. Эти проходящие электроны по-прежнему несли структурную информацию и формировали изображение на экране. Поскольку меньшее количество электронов откладывало энергию в материале, нагрев и радиационное повреждение были меньше, что позволяло использовать более длительную экспозицию и получать более мелкие детали.

К 1934 году Руска опубликовал эти результаты и даже высказал предположение о возможности визуализации биологического материала. Он заявил: «Эта микроскопия доступна для любых объектов (включая все органические), при условии, что их можно подготовить в виде достаточно тонких плёнок и поместить в вакуум без повреждения (изменения структуры)». И: «Для лучшей визуализации таких объектов — например, нервных волокон с их чрезвычайно тонкой структурой — возможно, потребуется разработать методы «окрашивания», адаптированные к данной задаче, такие как пропитка металлическими солями (посеребрение), аналогичные тем, которые уже широко используются в обычной гистологической микроскопии».

Между тем, конструкция Рюденберга так и не была построена в Siemens. Политические потрясения в Германии остановили его продвижение по службе, а его жизнь как немца еврейского происхождения оказалась под угрозой. В 1936 году с помощью Siemens он вместе с семьёй бежал в Англию, а два года спустя эмигрировал в США, где стал профессором электротехники в Гарварде.

По иронии судьбы, как к немцу, к Рюденбергу относились неоднозначно; в 1942 году, во время войны, его американские патенты на электронный микроскоп были конфискованы Управлением по контролю за имуществом иностранных граждан, государственным органом, занимавшимся конфискацией активов, принадлежащих гражданам вражеских стран в военное время. После войны ему пришлось вести длительные судебные тяжбы, чтобы вернуть их. Позже он консультировал Farrand Optical Company, небольшую компанию в Нью-Йорке, которая пыталась построить электростатический микроскоп на основе его патентов, но это предприятие потерпело коммерческую неудачу. К счастью, несмотря на все эти препятствия, его сын полностью выздоровел от полиомиелита.

От прототипа до коммерциализации

К началу 1930-х годов электронная микроскопия превзошла разрешающую способность световых микроскопов, обещая усилить увеличение на несколько порядков. Однако прогресс был неравномерным.

В Бельгии венгерский физик Ладислав Мартон к 1932 году сконструировал собственный прибор и получил первые биологические электронные микрофотографии: изображения насекомоядного растения Drosera intermedia и кроваво-красной бактерии Serratia marcescens.

Чтобы сделать такие хрупкие образцы видимыми, Мартон обратился к тетраоксиду осмия, соединению тяжёлого металла, которое прочно связывается с клеточными мембранами. Покрыв тонкие срезы Drosera intermedia осмием, он увеличил их способность рассеивать электроны, что привело к более чёткому контрасту на конечном изображении. Он также ввёл электронный затвор, устройство, которое блокировало электронный пучок во время фокусировки и открывалось только на короткий момент экспозиции. Это защищало хрупкие образцы от ненужного повреждения радиацией, при этом позволяя получать чёткие изображения. Какое-то время казалось, что Мартон лидирует в этой области.

Руска, который в 1933 году защитил докторскую диссертацию и устроился на работу в телевизионной индустрии, вернулся в эту область. Он объединил усилия с Бодо фон Боррисом, своим давним соратником и будущим шурином, чтобы продвинуть эту технологию к коммерческой жизнеспособности. В период с 1933 по 1935 год они подали восемь патентов и обратились к широкому кругу учреждений за финансовой поддержкой. Они обратились в Институт кайзера Вильгельма, правление производителя оптики Carl Zeiss и даже к сталелитейным компаниям, чтобы узнать, есть ли у них потребность в электронных микроскопах. Хотя первоначальные усилия с Zeiss казались многообещающими, они провалились, когда Zeiss отказался от сотрудничества из-за прав Siemens на более ранние патенты Рейнхольда Рюденберга.

Несмотря на эти неудачи, интерес к электронной микроскопии рос. В Технической школе в Берлине студенты модифицировали прототипы Руски, чтобы получить поразительные изображения волосков на ноге мухи, увеличенные в 25 000 раз. Чтобы сделать ткани более устойчивыми к лучу, они использовали дихромат калия, фиксатор, который сшивал липиды и белки в ткани, чтобы она меньше разрушалась или испарялась. Этот фиксатор также увеличивал контраст рассеяния, что облегчало различение мелких деталей.

Образцы охлаждали до –17 °C, что уменьшало тепловое движение и замедляло накопление тепла от неупругих столкновений электронов. Охлаждение не предотвращало радиационное повреждение, но задерживало его на достаточно длительный период, чтобы можно было записать изображения. Это были ранние исследования криогенных методов, которые позже определили эту область науки.

К 1936 году электронная микроскопия сосредоточилась вокруг очень активного (хотя и небольшого) сообщества, в которое входили Мартон в Бельгии, Руска и фон Боррис в Берлине, а также молодые исследователи из их университета, продолжавшие эту работу. Однако всем им по-прежнему не хватало финансовой поддержки для разработки коммерческой системы.

Ситуация изменилась, когда Руска выступил на Немецкой конференции физиков и математиков в 1936 году. Его брат Хельмут, врач, недавно назначенный в Берлинскую университетскую клинику, добавил важную медицинскую поддержку, продвигая потенциал микроскопа в медицинских приложениях. Эта медицинская достоверность вернула Siemens за стол переговоров. Поскольку и Siemens, и Zeiss проявили интерес, Руска и фон Боррис выбрали Siemens, которая уже владела патентами Рюденберга и обладала более сильной электротехнической экспертизой.

В феврале 1937 года, через десять лет после того, как Ганс Буш впервые сформулировал теорию электронной линзы, Siemens начала разработку первого коммерческого электронного микроскопа в Берлине. К 1938 году была готова первая модель, обеспечивающая увеличение до 30 000 раз.

Это устройство стало триумфом лабораторных экспериментов Руски и его неустанных усилий. В верхней части колонны микроскопа находился катод, генерирующий электроны, ускоряющиеся вниз под высоким напряжением. Конденсорная линза собирала, сужала и фокусировала электронный пучок для освещения образца, который вводился через небольшой вакуумный шлюз и удерживался на столике. Непосредственно под ним находилась объективная линза, мощная магнитная катушка, которая чётко фокусировала проходящие электроны, формируя первое промежуточное изображение. Вторая катушка, проекционная линза, затем увеличивала это изображение и проецировала его на флуоресцентный экран, где светлые и тёмные области показывали структуру образца. Исследователи могли просматривать светящееся изображение непосредственно через встроенное окно или фиксировать его на фотопластинках, расположенных под экраном. Для поддержания стабильной работы вся колонна поддерживалась в условиях высокого вакуума с помощью ртутного диффузионного насоса.

Была создана общая лаборатория Siemens, которая стала важным центром по производству одних из первых биологических электронных микрофотографий. Под руководством Хельмута Руски в ней было установлено четыре прибора, доступных для приглашённых учёных, многие из которых были биологами и медицинскими исследователями. Только в 1939 году было получено почти 2000 изображений, которые легли в основу 23 публикаций. Среди них были первые электронные микрофотографии вирусов, бактериофагов и мелких биологических деталей, которые никогда раньше не видели.

Сама лаборатория была разрушена во время воздушного налёта в 1944 году, и потребовалось почти десятилетие, чтобы Siemens в Германии восстановила свои позиции в области электронной микроскопии. Но к тому времени интерес к электронной микроскопии уже распространился: лаборатории в Великобритании и США продолжали развивать эту область, опираясь на фундамент, заложенный в Берлине. Эрнст Руска получил Нобелевскую премию по физике в 1986 году за свои фундаментальные работы в области электронной оптики и микроскопии.

Внутри электронного микроскопа

За промежуток чуть более века электронный микроскоп превратился из инструмента, едва способного различать вирусные частицы, в устройство, способное фиксировать детали строения атомов. Хотя его развитие в основном характеризовалось постепенными усовершенствованиями, оно также было отмечено ключевыми прорывами.

Например, с самого начала электронная микроскопия в биологии сталкивалась с проблемой воды. Поскольку микроскоп работает в условиях высокого вакуума, жидкая вода мгновенно испаряется, оставляя деликатные биологические образцы разрушенными или деформированными. Чтобы этого избежать, водные образцы приходилось сушить, фиксировать или окрашивать, что давало распознаваемые изображения, но с очевидными артефактами, такими как сжатые клетки, разорванные мембраны и структурные деформации, которые больше не отражали живое состояние. В 1940-х и 1950-х годах закрепление образцов в смолах и использование ультратонких срезов сделали видимой ультраструктуру клеток, а лиофилизация и ранние криогенные срезы позволили частично сохранить гидратированный материал, хотя результаты по-прежнему страдали от искажений.

Прорыв произошёл в начале 1980-х годов, когда Жак Дюбоше и его коллеги из Европейской лаборатории молекулярной биологии в Гейдельберге продемонстрировали, что воду можно остекловать, то есть охладить настолько быстро, что она затвердевает в стекло, а не кристаллизуется, что в конечном итоге позволяет сохранять и визуализировать биомолекулы в том виде, в каком они существуют в жизни.

Параллельно с этим совершенствовались вычислительные методы. Начиная с 1970-х годов, Йоахим Франк разработал статистические методы выравнивания и усреднения тысяч зашумлённых электронных микрофотографий отдельных макромолекул. Этот «анализ отдельных частиц» преобразовывал слабые, низкоконтрастные изображения в когерентные трёхмерные реконструкции. В сочетании с методом витрификации Дубоше эти два достижения привели к появлению криоэлектронной микроскопии одиночных частиц: молекулы, взвешенные в стеклообразном льду, можно было визуализировать в случайных ориентациях и с помощью вычислений объединять в детальные трёхмерные структуры.

Три десятилетия спустя, с появлением прямых детекторов электронов, разработанных благодаря усилиям Ричарда Хендерсона, и более мощных алгоритмов, криоэлектронная микроскопия одиночных частиц вступила в «революцию разрешения», регулярно предоставляя почти атомные детали и прочно утвердившись в качестве одного из центральных методов структурной биологии.

Сегодняшние самые современные криоэлектронные микроскопы имеют высоту почти в два этажа, стоят миллионы долларов и работают с поразительной точностью. Но они по-прежнему основаны на технологии, заложенной в 1930-х годах: пучок электронов, формируемый магнитными полями, взаимодействует с веществом, чтобы показать то, что не может показать свет.

В верхней части вертикальной колонны находится электронная пушка, источник луча. Тонкая вольфрамовая нить или острый наконечник с полевой эмиссией удерживаются под высоким отрицательным напряжением, часто 200–300 киловольт, чтобы электроны высвобождались и ускорялись вниз по колонне. При таких энергиях электроны движутся со скоростью, близкой к скорости света, с длинами волн, в тысячи раз короче видимого света, что даёт им необычайную разрешающую способность. Чтобы предотвратить рассеяние, колонна поддерживается в условиях сверхвысокого вакуума, так как даже следы газов могут отклонять или рассеивать пучок.

Магнитные линзы, изготовленные из спиральной проволоки, заключённой в железные полюсные наконечники, фокусируют и направляют электроны, подобно тому как стеклянные линзы преломляют свет. Конденсорная линза сужает луч на образце, а объективная линза формирует первое увеличенное изображение. Дополнительные проекционные линзы увеличивают это изображение и передают его на детектор.

Когда луч проходит через образец, электроны взаимодействуют с его атомами. Некоторые рассеиваются упруго, сдвигая фазу без потери энергии; другие рассеиваются неупруго, теряя энергию, и либо поглощаются, либо отфильтровываются. Проходящие электроны несут структурную информацию, закодированную в виде изменений амплитуды и фазы, и создают контрастное изображение на детекторе.

В крио-ЭМ собираются миллионы таких низкоконтрастных 2D-проекций, каждая из которых представляет собой зашумлённый снимок молекулы в случайной ориентации. Вычислительные алгоритмы выравнивают, классифицируют и объединяют их, используя математический метод, который разбивает изображения на лежащие в их основе волновые паттерны (с помощью преобразования Фурье), а затем соединяет эти паттерны обратно, чтобы сформировать подробную 3D-карту.

Результат сначала выглядит как зернистая микрофотография, но после сборки и доработки эта картина раскрывает необычайные детали: сотовую решётку графена, складки вирусного капсида или рибосому, застигнутую в процессе трансляции.

Сегодня ни один метод визуализации не позволяет зафиксировать всё. Для отслеживания быстрых процессов, молекул в живых клетках или визуализации целых организмов по-прежнему незаменима световая микроскопия. Для атомного разрешения хорошо упорядоченных белков по-прежнему нет ничего лучше рентгеновской кристаллографии.

Но когда речь заходит о преодолении масштабного разрыва между атомами и клетками, нет лучшего инструмента, чем электронный микроскоп. Тот же прибор, который в 1938 году позволил увидеть слабые силуэты вируса эктромелии мышей, сегодня позволяет различать вирусные белки на уровне химической связи — это прогресс, который помог биологам переосмыслить значение слова «видеть».

Смрити Сунил — научный сотрудник, занимающийся разработкой методов визуализации для изучения работы мозга на разных уровнях. Она разработала мультимодальные методы микроскопии, позволяющие объединить молекулярные, клеточные и системные измерения структуры и функций. Она также пишет о науке и метанауке в своём блоге Substack «Engineering Discovery».